Você já trabalha ou
gostaria de trabalhar com análises de transcriptoma? O Transcriptoma é o
conjunto total de RNAs transcritos em uma célula, um tecido, uma condição
fisiológica, etc. Em um primeiro
instante você pode se assustar com o termo transcriptoma, ou se deparar com a
falta de informações na literatura, pois as análises de expressão gênica
global usando o Sequenciamento de Nova Geração são um campo de pesquisa ainda em desenvolvimento dentro da biologia molecular. Por outro lado, não há duvidas que seu uso
será cada vez mais abrangente. Suas vantagens em relação a metodologias
tradicionais de análise da expressão gênica em larga escala são enormes, pois
além de identificar os diferentes níveis de expressão, podemos:
a) Identificar
transcritos raros e ainda não conhecidos
b) Identificar
novas variantes de splicing
c) Identificar
eventos de fusão gênica e quimeras
d) Genotipar
SNPs
Apenas para citar
alguns.
Mas para alcançar
estes beneficios, existem alguns detalhes importantes ao trabalhar com amostras
de RNA.
Nesta série de posts
que faremos, gostaria de compartilhar com vocês os principais passos para se
chegar num bom resultado nos trabalhos com RNA.
1.
Qualidade
da Amostra
Não há duvida que,
assim como para os trabalhos com DNA, a qualidade das amostras de RNA é o
primeiro passo para um bom resultado e uma análise confiável. Para obter um RNA
de qualidade é indispensável escolher a metodologia de extração que mais se adequa às condições da sua
amostra, podem ser kits comerciais, soluções caseiras, não importa, o que
importa é a qualidade do material extraído, que alem de não estar degradado,
precisa estar livre de inibidores, como proteínas e solventes orgânicos, que
podem influenciar as etapas posteriores.
As moléculas de RNA
são por natureza muito mais instáveis que o DNA, e sofrem degradação bastante
acelerada se não preservadas da forma adequada. Preservar a integridade do RNA é extremamente crítico para construir uma boa biblioteca
e produzir resultados confiáveis. Neste ponto é
praticamente indispensável o uso do Bioanalyzer (ou equipamento similar) para
verificar a integridade do RNA, o tão conhecido RIN (RNA Integraty Number).
Para uma análise de RNAs mensageiros e outros RNAs longos (ao que normalmente
nos referimos como Transcriptoma) é ideal que as amostras tenham um RIN igual
ou superior a 8, enquanto que para análises de RNAs pequenos, que normalmente
chamamos de miRNoma, um RIN de 6 – 7
seria o mínimo aceitável.
Fig. 2 –
Eletroferograma mostrando amostras de RNA total íntegro (RIN 10) e extremamente
degradado (RIN 2). Fonte: https://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-1165EN.pdf.
Neste ponto você pode
se perguntar: ”Bem, se eu preciso fragmentar o RNA durante o preparo da
biblioteca, por que eu não posso usar um RNA já fragmentado?”. A resposta pode
até parecer simples demais, mas é algo que
realmente precisa ser levado em consideração. Um RNA que já está naturamente
degradado dificilmente sofreu uma degradação inteiramente aleatória e,
certamente, isso se refletirá em um viés de análise no final do processo, com
uma representação alterada dos diferentes RNAs presentes na amostra inicial.
Há ainda um outro
ponto bastante crítico relacionado à amostra inicial, que é a quantificação do
RNA. Enquanto a praticidade e o custo reduzido nos tendenciam a usar o Nanodrop
(ou equipamento similar), é preciso ter em mente que os espectofotômetros, de
forma geral, extrapolam as quantificação, pois mensuram não apenas o RNA, mas
também o DNA e outras moléculas presentes na solução. Não é raro vermos uma
superestimativa de até 10X em muitas amostras. Tendo isso em mente, a melhor
alternativa para quantificação do RNA, assim como do DNA e Proteínas, é a
fluorometria, como o Qubit, que usa um corante específico para cada tipo de molécula
a ser quantificada (RNA, DNA e Proteína), garantindo a especificidade da
quantificação. Por outro lado, o uso do Nanodrop não está dispensado, com ele é
possivel avaliar a qualidade da amostra através das relações 260/230 e 260/230,
que podem indicar a presença de proteínas e solventes orgânicos. Esta
triangulação - Bioanalyzer x Nanodrop x Qubit - é peça chave para os trabalhos
com RNA.
Tendo analisado a
qualidade do RNA total, é preciso agora depletar o RNA-ribossomal, que representa
de 90 a 95% de todo o RNA presente nas células humanas, por exemplo. A
quantidade de rRNA é muito grande, e, sem um tratamento para eliminá-las, serão
produzidos apenas resultados desses rRNAs. A depleção do RNA ribossomal pode
ser feita através de kits como o Ribominus . Outra estratégia é isolar apenas o mRNA, usando, por exemplo, kits do tipo poli-A. A Life Technologies tem ótimas soluções para vários tipos de amostras.
Independente de usar um kit para depleção do rRNA ou um kit que isola os mRNAs a partir da sua cauda poli-A, ou mesmo ter interesse apenas nos microRNAs, é sempre recomendado fazer a extração do RNA total inicialmente, pois é apenas com o RNA total que podemos acessar o RIN. Depois desta análise inicial do RIN podemos seguir com o protocolo de depleção ou enriquecimento dos mRNAs ou microRNAs e quantificar com o Qubit para iniciar o preparo da biblioteca, observando atentamente todos os passos do protocolo, que já foi extensivamente validado.
Independente de usar um kit para depleção do rRNA ou um kit que isola os mRNAs a partir da sua cauda poli-A, ou mesmo ter interesse apenas nos microRNAs, é sempre recomendado fazer a extração do RNA total inicialmente, pois é apenas com o RNA total que podemos acessar o RIN. Depois desta análise inicial do RIN podemos seguir com o protocolo de depleção ou enriquecimento dos mRNAs ou microRNAs e quantificar com o Qubit para iniciar o preparo da biblioteca, observando atentamente todos os passos do protocolo, que já foi extensivamente validado.
RNA sequencing - advances, challenges and opportunities - 2010.pdf
Transcriptome analysis using next-generation sequencing - 2013.pdf
